Родился в богатой и знатной семье; отец получил наследственный титул маркиза за военные заслуги. В 1564 году поступил в Падуанский университет, где подружился с Торквато Тассо. Здесь в нём пробудился живой интерес к науке. Затем юноша участвовал в военных действиях против турок-осман, в основном как военный инженер. По окончании кампании он вернулся в родное имение и посвятил себя изучению различных наук, преимущественно математики, астрономии и физики.
В 1588 году был назначен главным инспектором укреплений тосканского герцогства.
Около 1586 года он обратил внимание на 22-летнего талантливого физика и математика Галилея, к этому времени — автора нескольких оригинальных книг и изобретений, но оставшегося без средств к существованию. Маркиз взял его под своё покровительство и (через посредство своего брата-кардинала) представил тосканскому герцогу Фердинанду I Медичи. Это помогло Галилею получить свою первую научную должность, кафедру в Пизанском университете. Спустя 3 года (1592) маркиз помог Галилею стать профессором Падуанского университета, где он совершил свои знаменитые телескопические открытия.
Гвидобальдо скончался в Монтебароччо (Montebaroccio) в 1607 году.
В XVI—XVII веках Гвидобальдо пользовался большим уважением, в первую очередь как теоретик механики. Известно, что его труды изучал Декарт. Даже в XIX веке цитаты из работ Гвидобальдо можно найти в статьях Лагранжа.
Гвидобальдо написал труд по механике, Mechanicorum Liber, где впервые изложил принцип возможных перемещений. На основе этого принципа он изложил вывод условий равновесия рычага и блока. Книга включает также теорию простых машин: рычага, ворота, блоков и полиспастов.
Другой научный труд Гвидобальдо относится к математической теории перспективы и называется Perspectivae (в 6 книгах), опубликован в 1600 году. Книга приобрела немалую популярность среди художников, архитекторов и театральных режиссёров. Астрономический труд De cochlea был издан посмертно.
Дель Монте принадлежат несколько изобретений, в том числе оригинальный чертёжный инструмент, предназначенный для вычерчивания правильных многоугольников и деления отрезка на равные части.